VISITA GUIADA A ECUAGENERA....

ETAPA IN VITRO:


Cuando las semillas germinan, son colocadas en frascos con medio de cultivo, estos frascos esteriles, son tapados con algodon esteril y sellados con strech film.

Los frascos con plantas, son almacenados en estanterias colocadas en una area de buena iluminacion.



Cuando alguno de los frascos se contamina, debe ser inmediatamente retirado de las demas.




ETAPA DE COMUNITARIO:



En esta etapa, las plantas son sacadas del frasco y colocadas en bandejas con sustrato.

El Sustrato esta compuesto por Compost, Helecho y Pino. El Helecho y el pino se deja secar antes de mezclarlo con el compost. Cuando el helecho y el pino esta seco se mezcla con el compost y se trilla, luego, se deja remojar por espacio de 24 horas antes de ser utilizado.



Los riegos se realizan 1 vez por semana por espacio de 15 minutos.


La temperatura maxima debe ser de 30ºC.


Se realizan 2 fertilizaciones por semana, via drenchs se aplica nitrato de potasio y nitrato de calcio.


ETAPA INDIVIDUAL:

La etapa individual empieza en cuanto se empiezan a formar bulbos, es la señal de que debemos transplantarlas a una maceta individual.

Se empiezan a aplicar las fumigaciones. Se riegan 1 vez por semana por espacio de 30 minutos. Se empiezan a realizan deshierbas.

ETAPA DE FLORACION:




En esta etapa la fertilizacion es 1 vez por semana y el riego depende de la humedad, este puede ser 1 o 2 veces por semana.



Cuando se establecen bandas de floracion, se colocan otras plantas en la parte baja para aumentar la humedad.

AREAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO IN VITRO

Se pueden distinguir 3 areas importantes:

CAMARA DE FLUJO LAMINAR

Contenido:

• Cabina de Flujo Laminar
• Silla

Es llamada así por que contiene en su interior un Cabina de Flujo Laminar; es el área mas estéril del Laboratorio, todo lo que ingrese en esta área debe estar debidamente esterilizado (material de vidrio, agua destilada), y el personal deberá entrar con el equipo necesario, es decir, con guantes, tapones para oídos, forro para pies, Mandil limpio y mascarilla quirúrgica.

Esta área deberá ser limpiada después de realizar cualquier trabajo en su interior, para asegurar su condición aséptica.

Esta zona debe estar completamente aislada de las otras, se debe evitar que entre el polvo o los insectos.

Se puede reemplazar un cabina de flujo laminar, con una caja de vidrio con orificios para que puedan entrar las manos y los materiales necesarios, ademas el aislamiento se lo puede hacer con plastico y cinta metalica, esta forma es lo mas artesanal posible.

Cuando se realiza esta area de forma artesanal, se desinfecta la caja de vidrio con una bomba de permanganato y formol, tiempo en el cual no debe estar nadie en el interior porque puede ser peligroso. Con ayuda de una lampara de tubo fluorescente, se procede a reemplazar el tubo fluorescente por un tubo de luz uv, el mismo q se enciende media hora antes de la siembra, igualmente, no debe haber alguna persona en este tiempo.

AREA DESARROLLO IN VITRO:

Contenido:

• Repisas de Vidrio de varios pisos
• Lamparas de tubo fluorescente.
• Frascos Sembrados.
• Termometro

Es el área donde se colocara el explante después de la siembra, y donde además se desarrollara durante todas fases del programa. El explante, será colocado sobre repisas de vidrio, con iluminación artificial.

Las luces deberán encenderse al empezar el día de trabajo y se apagaran al finalizar la jornada de trabajo. La limpieza es esencial, cuando un frasco se contamina en alguna parte del proceso, el mismo es retirado de la repisa y llevado un lugar despejado para ser eliminado.

Las repisas requieren un area esteril como el de la cabina de flujo laminar.

AREA DE TRABAJO:

Contenido:

• Balanza analitica
• refrigeradora
• Autoclave
• Lavaplatos
• Cocina

Anaqueles de almacenamiento(para frascos, instrumentos, reactivos y papeleria).

Es un área de transito abierto, en este lugar se recibe, procesa y desinfecta todo (sustrato, medio de cultivo, material), para que entre asépticamente a las cámaras.

Consta como la entrada principal y es en la cual se deberá controlar el ingreso a las áreas más estériles del laboratorio.

SIEMBRA PARA UNA CEPA (Trichoderma harzianum)

DE UN CRIOTUBO A UNA CEPA

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Cerca del mechero de alcohol, se abre el criotubo y con un agitador desinfectado se agita el contenido del vital, para que quede homogéneo. Se rocía la aguja de la jeringa con alcohol y se acerca a la flama del mechero, manteniéndolo hasta que llegue al rojo vivo.

Cuando alcanza el rojo vivo, se enfría la aguja en el medio de una caja Petri. Después se introduce la aguja en el criotubo y se siembra de varias formas:

· Se hace un rayado en forma de cuadrado en el medio PDA.

· Se dejan caer unas gotas en el medio PDA.

· Se realizan las dos anteriores juntas.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

DE UNA CEPA A OTRA CEPA (REPLICADO DE CEPAS)

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Se rocía alcohol en el sacabocado y se flamea en el mechero de alcohol hasta que llegue al rojo vivo, se la enfría antes de realizar el bocado.

Cerca del mechero de alcohol, se abre caja petri con la cepa y con la ayuda de un sacabocados, se marcan circunferencias de 5 mm de diámetro. Con la ayuda de un agua flameada, se coge un bocado de la cepa y se coloca en el centro de una caja Petri con medio PDA.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

DE UN SUSTRATO A UNA CEPA

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Se rocía alcohol la aguja de una jeringa y se flamea en el mechero de alcohol hasta que llegue al rojo vivo. Luego se enfría la aguja en el medio de cultivo de una caja Petri, y con la misma aguja se coge un grano del sustrato colmado por el antagonista a sembrar y se coloca en el centro de una caja Petri con medio PDA.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

ELABORACION DE MEDIO PDA

Con una probeta, se mide la cantidad de agua destilada necesaria para el número de cajas Petri que necesitemos y la colocamos en un vaso de precipitación o en un matraz.

RELACION DEL MEDIO DE CULTIVO
MEDIO PDA: 9,75 gr
Agua destilada: 240 ml

Con la ayuda de una Balanza Analítica y una cuchara, se pesa el medio de cultivo, en este caso es PDA (papa-dextrosa-agar), y lo vertimos en el matraz o vaso de precipitación que contenía agua destilada.

Se agita vigorosamente hasta que el PDA se disuelva. Una vez disuelto, se tapa el recipiente con un pedazo de papel aluminio y se ajusta con un pedazo de plástico film alrededor de la boca del envase.

Con la ayuda de un fosforo se enciende la hornilla, con una llama media. En una olla grande se llena hasta los 5 cm. de altura y se introduce en ella una parrilla para hacer el efecto de Baño María.

Se coloca papel periódico en la base de la parrilla y en las paredes de la olla. Cuando el agua llega a punto de ebullición se coloca el PDA, está es envuelta en una franela antes de ser colocadas.

Se tapa y con la ayuda de un cronometro se contabilizan 1 hora y media antes de ser apagada. Después esperamos a que la temperatura baje, esto se lo corrobora con la ayuda de un termómetro.

Cuando la temperatura baja se retira el medio PDA y lo lleva a la cámara de flujo laminar, junto con las cajas Petri esterilizadas. La temperatura del PDA tiene que estar tibia o se solidificara.

Antes utilizar la Cámara de Flujo Laminar, se mantiene encendida la luz UV por 5 minutos.

Con el equipo apropiado (guantes, mandil, forro de pies y mascarilla), se ingresa a la cámara e flujo laminar. Se apaga la luz UV y se retira la tapa que cubre la Cámara de Flujo Laminar y se la enciende.

Se sienta frente a la Cámara de Flujo Laminar y se atomiza alcohol antiséptico sobre un algodón, y con este mismo se procede a limpiar la superficie interna de la Cámara de Flujo Laminar y cada uno de los materiales que se utilizaran. Se enciende el mechero de alcohol. Se abre el paquete de cajas petri y se las distribuye en la mesa de la cabina de flujo laminar, Se destapa el frasco con medio PDA y se dispensa 20 ml por caja petri.

Cuando se terminan de dispensar el PDA en las cajas petri, se retira el recipiente que contenía el PDA y se apaga el mechero.

Se apaga la cabina de flujo laminar, y con las cajas petri en el interior se coloca la tapa de la cabina y se enciende la luz UV por 5min