AREAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO IN VITRO

Se pueden distinguir 3 areas importantes:

CAMARA DE FLUJO LAMINAR

Contenido:

• Cabina de Flujo Laminar
• Silla

Es llamada así por que contiene en su interior un Cabina de Flujo Laminar; es el área mas estéril del Laboratorio, todo lo que ingrese en esta área debe estar debidamente esterilizado (material de vidrio, agua destilada), y el personal deberá entrar con el equipo necesario, es decir, con guantes, tapones para oídos, forro para pies, Mandil limpio y mascarilla quirúrgica.

Esta área deberá ser limpiada después de realizar cualquier trabajo en su interior, para asegurar su condición aséptica.

Esta zona debe estar completamente aislada de las otras, se debe evitar que entre el polvo o los insectos.

Se puede reemplazar un cabina de flujo laminar, con una caja de vidrio con orificios para que puedan entrar las manos y los materiales necesarios, ademas el aislamiento se lo puede hacer con plastico y cinta metalica, esta forma es lo mas artesanal posible.

Cuando se realiza esta area de forma artesanal, se desinfecta la caja de vidrio con una bomba de permanganato y formol, tiempo en el cual no debe estar nadie en el interior porque puede ser peligroso. Con ayuda de una lampara de tubo fluorescente, se procede a reemplazar el tubo fluorescente por un tubo de luz uv, el mismo q se enciende media hora antes de la siembra, igualmente, no debe haber alguna persona en este tiempo.

AREA DESARROLLO IN VITRO:

Contenido:

• Repisas de Vidrio de varios pisos
• Lamparas de tubo fluorescente.
• Frascos Sembrados.
• Termometro

Es el área donde se colocara el explante después de la siembra, y donde además se desarrollara durante todas fases del programa. El explante, será colocado sobre repisas de vidrio, con iluminación artificial.

Las luces deberán encenderse al empezar el día de trabajo y se apagaran al finalizar la jornada de trabajo. La limpieza es esencial, cuando un frasco se contamina en alguna parte del proceso, el mismo es retirado de la repisa y llevado un lugar despejado para ser eliminado.

Las repisas requieren un area esteril como el de la cabina de flujo laminar.

AREA DE TRABAJO:

Contenido:

• Balanza analitica
• refrigeradora
• Autoclave
• Lavaplatos
• Cocina

Anaqueles de almacenamiento(para frascos, instrumentos, reactivos y papeleria).

Es un área de transito abierto, en este lugar se recibe, procesa y desinfecta todo (sustrato, medio de cultivo, material), para que entre asépticamente a las cámaras.

Consta como la entrada principal y es en la cual se deberá controlar el ingreso a las áreas más estériles del laboratorio.

SIEMBRA PARA UNA CEPA (Trichoderma harzianum)

DE UN CRIOTUBO A UNA CEPA

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Cerca del mechero de alcohol, se abre el criotubo y con un agitador desinfectado se agita el contenido del vital, para que quede homogéneo. Se rocía la aguja de la jeringa con alcohol y se acerca a la flama del mechero, manteniéndolo hasta que llegue al rojo vivo.

Cuando alcanza el rojo vivo, se enfría la aguja en el medio de una caja Petri. Después se introduce la aguja en el criotubo y se siembra de varias formas:

· Se hace un rayado en forma de cuadrado en el medio PDA.

· Se dejan caer unas gotas en el medio PDA.

· Se realizan las dos anteriores juntas.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

DE UNA CEPA A OTRA CEPA (REPLICADO DE CEPAS)

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Se rocía alcohol en el sacabocado y se flamea en el mechero de alcohol hasta que llegue al rojo vivo, se la enfría antes de realizar el bocado.

Cerca del mechero de alcohol, se abre caja petri con la cepa y con la ayuda de un sacabocados, se marcan circunferencias de 5 mm de diámetro. Con la ayuda de un agua flameada, se coge un bocado de la cepa y se coloca en el centro de una caja Petri con medio PDA.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

DE UN SUSTRATO A UNA CEPA

Se prepara y desinfecta la camara de flujo laminar, se enciende la cabina de flujo Laminar y el mechero de alcohol; Se atomiza alcohol, sobre el material a utilizar (jeringa, agitador, algodon y el vital del antagonista a sembrar). Con un algodón empapado de alcohol, se limpia la mesa de la cabina de flujo laminar.

Se rocía alcohol la aguja de una jeringa y se flamea en el mechero de alcohol hasta que llegue al rojo vivo. Luego se enfría la aguja en el medio de cultivo de una caja Petri, y con la misma aguja se coge un grano del sustrato colmado por el antagonista a sembrar y se coloca en el centro de una caja Petri con medio PDA.

Cuando se terminan de sembrar todas las cajas Petri, se coloca tape alrededor de cada una, procurando que quede sellada. Luego se corta plástico film y se envuelve la caja Petri, procurando estirarla para que se pegue mejor, después se marca con la fecha de siembra.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA EL ANALISIS DE C.E., pH Y NITRATOS EN LOS SUELOS FLORICOLAS (II PARTE).

1. LECTURA DE C.E., pH Y NITRATOS

Transcurridas las 12 horas, se vierte el extracto en otro recipiente, se encienden los equipos (peachimetro y conductimetro), y se alzan los electrodos.

Se coloca el extracto bajo los electrodos, y se los desciende para que entre en contacto con dicho extracto, se esperan unos segundos para que los equipos se estabilicen y se procede a leer.

El peachimetro indica el valor del pH, el cual se lo regisra en los registros según la variedad y la valvula del cual fue tomada.

El conductimetro indica el valor de C.E.; el valor puede estar expresado en mS/cm, o µS/cm. Si es mS/cm se coloca el valor que registra el conductimetro con 1 decimal. es decir en el ejemplo seria 2.5; pero, si es µS/cm, la unidad del dato que registra el conductimetro se divide para 1000 antes de registrarlo y se coloca igualmente un decimal, entonces seria 1,3.

Para tomar Nitratos se utiliza las tiras del test de nitratos, el procedimiento es introduciendo la tira unos segundos en el extracto, luego se lo retira y se toma la medida. Cuando la cinta ha coloreado, se ubica el color en la escala dada en el envase del test de nitratos, se registra dicho valor.

Una vez que se han tomado los datos, se levantan los electrodos y se limpian los mismos con una pizeta con agua destilada, antes de colocar el nuevo extracto.

Cuando se han tomado todos los datos, se lavan los electrodos y se los deja inmersos en un recipiente con agua destilada.

2. LOS DATOS.

Los datos son colocados en el registro de C.E., pH y NO3. Cuando se termina de obtener todos los datos, se evalúan las muestras, colocando una (x) en las muestras que están por encima o por debajo del rango y un visto cuando estén dentro del rango.

Los rangos varían de una especie a otra, y están marcados en la cabecera de cada casilla y son:

Se suman el total de muestras analizadas, además del número de deméritos de cada categoría (C.E., pH y NO3). Con los datos anteriores, se obtiene la eficiencia, la misma que se obtiene con la siguiente fórmula:

% EFICACIA CE.pH.NO3 = ((N – Dt) x 100) / (N)

Donde:

N: Total de muestras analizadas
Dt: Total de muestras con demerito
100: Constante

Cuando se terminan se sacar todos los porcentajes de eficiencia, se suman los deméritos que se encontraron por debajo del rango y se saca el porcentaje en relación al total de muestras analizadas.

% DEMERITO < rango =" ((Dt">

Donde:

N: Total de muestras analizadas

Dt <: Total de muestras con demerito por debajo del rango.

100: Constante

% DEMERITO > RANGO = ((Dt >) x 100) / (N)

Donde:

N: Total de muestras analizadas
Dt >: Total de muestras con demerito por arriba del rango.
100: Constante

Los datos de C.E., pH y NO3, son colocados en la carpeta de REGISTRO DE C.E., Ph, NO3, y deberán ser firmados por el Jefe de Cultivo de cada área. Al finalizar el mes, se promedian los valores que se obtuvieron en las dos semanas y si este promedio esta por debajo del 60%, se marca en rojo.

Las aplicaciones de fertilizantes en el cultivo de Rosas se las realizaran siempre que la CE, este menor o igual a 1,3 mmhos, en el caso de flores de verano se realizara la aplicación de fertilizante cuando la C.E sea menor o igual a 1 mmhos. En variedades como Gerberas y Minigerberas,se fertilizara siempre que el C E este menor o igual a 2,0, En Gypsophila Perfecta y, Million Star se fertilizara siempre que la CE este menor o igual a 1,8 mmhos .

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA EL ANALISIS DE C.E., pH Y NITRATOS EN LOS SUELOS FLORICOLAS (I PARTE).

1. DE LA TOMA DE MUESTRAS EN ROSAS.

Para obtener una muestra, hay que recolectar 8 sub-muestras (2 muestras por cama). Las 4 camas son siempre las y están marcadas por una señal de pintura.

Las 4 camas serán la 2da y penúltima de la variedad e igualmente las enfrentadas.

Los sitios de toma en las camas son siempre el 3ro y 6To cuadro en camas de 30 metros, o, el 2do y 4to cuadro en camas de 15 metros.

La sub-muestra se toma en el centro de la cama, exactamente en la mitad entre las dos líneas de mangueras de goteo. En el caso que en la cama se haya colocado compost se remueve el compost del sitio donde se toma la sub-muestra para asegurar que no existe compost en la muestra a analizar.

Se introduce el barreno hasta una profundidad de 20 cms. Los 5 cm superiores se descartan y el resto es colocado en un balde, hasta terminar de recolectar todas las sub-muestras.

Foto 1. y 2. Barrenado de las sub-muestra.

Una vez recolectadas las 8 sub-muestras, se procede a mezclarlas bien en el mismo balde donde se las fue colocando luego de ser recolectadas.

De esta mezcla de tierra se toma aproximadamente media libra, y se procede a colocarla en una funda plástica identificada con el nombre de la valvula y la variedad, para luego ser llevada al laboratorio para su análisis.

Foto 3. Etiqueta de identificacion. Foto 4. Muestras listas para ser procesadas.

Las muestras se toma en un ciclo de dos semanas. Semana par todo lo que es rosas. Los datos serán colocados en el letrero y colocado por valvula a manera de historial en rosas y la toma de muestras se realizara de lunes a martes de lo que esta fertilizado. La misma persona toma todas las muestras.

2. TOMA DE MUESTRAS PARA FLORES DE VERANO

Para obtener una muestra, hay que recolectar varias sub-muestras (muestras por cada variedad que tenga una válvula). Las camas en flores de verano no son siempre las mismas. Las muestras se toman en las camas donde las plantas se encuentran en estado vegetativo y según el programa de fertilización han sido fertilizadas de cada variedad.

Foto 5. Cama fertilizada, señalizada con la bandera.

Las variedades fertilizadas, estarán identificadas por un banderín azul. Los sitios de toma en las camas son siempre El 3ro y 6To cuadro en camas de 30 metros, o, El 2do y 4to cuadro en camas de 15 metros.

La sub-muestra se toma en el centro de la cama, exactamente en la mitad entre las dos líneas de mangueras de goteo. En el caso que en la cama se haya colocado compost se remueve el compost del sitio donde se toma la sub-muestra para asegurar que no existe compost en la muestra a analizar.

Se introduce el barreno hasta una profundidad de 20 cms. Los 5 cm superiores se descartan y el resto es colocado en un balde, hasta terminar de recolectar todas las sub-muestras.

Una vez recolectadas las sub-muestras de las variedades de una válvula, se procede a mezclarlas bien en el mismo balde donde se las fue colocando luego de ser recolectadas. De esta mezcla de tierra se toma aproximadamente media libra, y se procede a colocarla en una funda plástica identificada con el nombre de la válvula y la variedad, para luego ser llevada al laboratorio para su análisis.

Los datos serán colocados en el letrero y colocado por valvula a manera de historial en las variedades perennes, como son: million star, gerberas, hipericum, solidago, limonium, y delphinium.

La toma de muestras se realizara de lunes a martes de lo que esta fertilizado. La misma persona toma toma todas las muestras.

3. DEL PROCEDIMIENTO EN EL LABORATORIO
3.1. PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Las muestras de tierra se separan por la zona donde fueron recolectadas. Aun en la funda se mezcla vigorosamente la muestra. Se corta la etiqueta de la muestra. Con la tierra de la muestra se llena por completo el “Envase de Medición”. La tierra en este envase debe ser compactada siempre con la misma presión.

Foto 6. Llenado del envase de medicion con la muestra.

La tierra del envase de medición, se coloca por completo en el frasco de agitación (volumen de aproximadamente 0.75 litros). Después se llena el envase de medición con agua destilada y también se vierte en el frasco de agitación, luego nuevamente se llena el envase de medición con agua destilada y nuevamente se vierte en el frasco de agitación, según señala el “Método Holandés”.

Foto 7. Agitacion de la mezcla obtenida.

Se tapa el frasco de agitación y se lo agita fuertemente con la mano durante 1 minuto. Pasado el minuto, se lo transfiere a otro envase sin tapa y se lo deja reposar ese extracto hasta la mañana del día siguiente.

Foto 8. Colocacion del extracto en el envase de medicion.

Foto 9. Frascos en proceso de sedimentacion del extracto.