Cultivo in Vitro de Crisantemo: Desinfecion y Siembra

1. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1.1.INICIACION

Se toma un Erlenmeyers, un vaso de precipitación o una olla de acero inoxidable de 1 litro y se lava con agua destilada el interior. Para preparar 1 litro de medio de iniciación, se agregan 200 ml de agua y las soluciones madres en la siguiente proporción adecuada:

MS (Macronutrientes): xxx

ms (Micronutrientes): xxx

inositol: xxx

vitaminas: xxx

quelato de hierro: xxx

hormonas: xxx

azucar: xxx

Gel: xxx

Foto 1. Preparacion del medio del cultivo. der.) agregacion de las soluciones madres. izq.) Virtiendo el Inositol en el medio de cultivo.

Se agita y se enrraza a 990 ml. Con la ayuda de una tira del test de Ph se ajusta el mismo a 5.5 (Se regula el ph con HCL diluido con agua destilada). Se adiciona el gel, se tapa y se lleva a ebullición.

Foto 2. der) inmersion de la tira de test de pH. Izq) verificacion del pH.

Cuando ha hervido, se retira del fuego y y se deja reposar unos 15 minutos. Después se dispensan 20 ml. en frascos con capacidad de 100 ml. Se tapa la boca del frasco con redondeles de papel aluminio.

Foto 3. Proceso de dispensamiento del medio de cultivo en frascos.

1.2. ESTERILIZACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Se colocan los frascos dentro de el autoclave. Se tapa asegurando bien el autoclave y con la ayuda de un fosforo se enciende la hornilla, con una llama media y se lleva al fuego el utoclave.

Cuando la flecha del manómetro indica que se llego a 15 libras de presión, se trata de estabilizarlo ahí durante 5 minutos y luego se lo retira del fuego. Antes de abrir el autoclave, hay que esperar a que el manómetro indique “0”.

Foto 4. der) colocacion de los frascos con medio de cultivo en el autoclave. Izq) Esterilizacion del medio de cultivo en el autoclave.

Cuando la presión ha descendido totalmente, se lleva el autoclave a la cámara de flujo laminar para abrirla

2.MANEJO DEL MATERIAL VEGETAL
2.1. RECOLECCIÓN Y DESINFECCIÓN

Se seleccionan las camas donde se recolectaran los esquejes; estas camas deben tener plantas sanas.

Foto 5. Plantas madres de crisantemo.

En horas de la mañana se cortan esquejes de 15 cm., los que son transportados al laboratorio en un recipiente con una franela encima.

En el laboratorio se los coloca bajo el chorro de agua para evitar el estrés del esqueje. Con la ayuda de una tijera, se cortan las hojas, dejando el esqueje sin hojas, pero con parte de la nervadura que envuelve a la yema

Foto 6. Der) Recepcion de los esquejes de crisantemo en el laboratorio. Cent)Esqueje de crisantemo. Izq) Corte de las hojas.

Con la ayuda de un cedazo, se dejan los esquejes sin hojas a chorro continuo por espacio de 5 minutos.

Se cortan los esquejes muy grandes y se introducen en un recipiente con agua destilada para enjuagarlos.

Foto 7. Esquejes de crisantemos listos paar empezar la desinfeccion.

Se vuelve a colocar agua destilada hasta el nivel que cubra a los esquejes y se agregan 0.2 ml. de phyton. Los dejamos reposar 5 min y luego los lavamos con agua destilada.

Se prepara una solución de 20% hipoclorito de sodio y 80% agua destilada, y se vierte en el recipiente con los esquejes y se tapa la boca del recipiente con una redondéla de aluminio. Se dejan los esquejes en esta solución por 20 minutos y se los lleva a la cabina de flujo laminar.

Foto 8. Esquejes de crisantemo inmersos en una solucion de agua con phyton.

2.2. SIEMBRA INICIAL

Se preparan y esterilizan previamente las cosa que se utilizaran en la cámara de flujo laminar (papel, algodón, bisturí, agua destilada, medios de cultivo).

Se retira la tapa de la cabina de flujo laminar y se enciende la misma. Se limpian los frascos con medio de cultivo para ingresarlos a la cabina (la limpieza es con alcohol antiséptico y algodón esterilizado.

Foto 9. Der) material esterilizado previamente. Izq) atomizacion de alcohol en la mesa de trabajo.

Se limpia la mesa de trabajo de la cabina con alcohol antiséptico y algodón estéril. Se atomiza alcohol sobre el frasco con los esquejes en cloro, los frascos con cisteína y recipientes vacíos, para luego secarlos con algodón esterilizado. Se enciende el mechero de alcohol.

Se flamea el soporte de los instrumentos (tapa de caja petri), el bisturí y la pinza, para luego atomizar alcohol industrial sobre parte de la mesa y flamearla también.

Foto 10. der, cent, izq) Flameacion de las pinzas, caja petri y mesa de trabajo respectivamente.

Transcurrido el tiempo de los esquejes en cloro, se ciernen los mismos y con agua destilada esterilizada se procede a lavarlos varias veces, para retirar todo rastro de cloro. Se vuelven a sumergir los esquejes en agua destilada y se colocan tres gotas de cloruro de mercurio, se agita fuertemente y se escurre el agua, se lava varias veces con agua destilada esterilizada y se escurre.

Foto 11. der y Cent) lavado de los esquejas en la cabina de flujo laminar. Izq.) adicion del cloruro de mercurio.

Se limpia la mesa de trabajo con un algodón esterilizado y alcohol industrial. Se extiende un papel esterilizado en la mesa de trabajo y se colocan sobre este los explantes.

Foto 12. Manejo de los esquejes antes del corte a explante.

Con la ayuda de una pinza, se sujeta el esqueje para que con un bisturí se pueda realizar el corte del mismo.

Foto 13. Der) esqueje antes del corte. izq) Corte del explante. abaj) explante o inoculo

Una vez cortados, con la ayuda de una pinza se colocan los explantes en los frascos con agua con cisteína, hasta que se termine de preparar todos los explantes.

Se retira el papel usado y se limpia la mesa con alcohol y algodón esterilizado, antes de extender otro papel limpio.

foto 14. Der) Explantes antes de la inmersion en cisteina. izq) Limpieza de la mesa de trabajo. abaj) Explantes inmersos en cisteina.

Cuando al fin se ha terminado de realizar todos los cortes, se acercan los frascos con medio de cultivo. Se extiende un papel esterilizado y con ayuda de una pinza se sacan los explantes inmersos en cisteína para colocarlos sobre el papel. Se abre suavemente la tapa del frasco con medio esterilizado. Se flamea la pinza y se deja enfriar un poco.

Foto 15. Proceso de siembra de los explantes.

Con la pinza se coge el explante y se lo deposita en el medio, este no debe quedar totalmente sumergido en el medio. Se tapa nuevamente el frasco y se ajusta hasta terminar de sembrar todos.

Foto 16. arrib) siembra de explante. der e izq) Explante sembrado de forma adecuada y acostado respectivamente.

Cuando se termina de sembrar todos los explantes, se retiran de la cabina de flujo laminar y se apaga la misma, luego se envuelve en plástico strech film cada uno de los frascos. Paar finalizar se llevan los frascos a un area esteril y sin luz por 8 dias, despues de esto se retiran los contaminados y se lleva el resto a estanterias con tubos de luz fluorescente.

Foto 17. Sellado de los frascos sembrados.